一、涂片、干燥、固定、初染(媒染)、脱色、复染??
(1)?涂片:临床标本或液体培养物可直接涂抹于洁净的载玻片上,固体培养的细菌先在玻璃片上滴一滴生理盐水,然后取菌少许在盐水中磨匀,呈轻度混浊。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右为宜。?
(2)干燥??涂片最好在室温下自然干燥,或将标本面向上,置于酒精灯火焰高处慢慢烘干,切不可在火焰上烧干。?
(3)固定??细菌的固定常用火焰加热法,即将上述已干的涂片在火焰中迅速通过3~5次,温度以手能摸时热而不烫为度。目的在于杀死细菌,凝固细胞质,改变细菌对染料的通透性。?
(4)?初染:不同的染色方法,所用染液也不同。染液以覆盖菌膜为度。?
(5)?媒染:通过媒染可增加染料和被染物质的亲和力。媒染剂还可用于固定之后,亦可含在固定液或染液中。?
(6)?脱色:此步骤主要目的是观察细菌与染料间结合的稳定程度,作为鉴别染色之用。?
(7)?复染:细菌初染色被脱色后常以复染液复染,便于观察。复染液的颜色与初染液有明显不同。??

二、常用染料原液配制?
?一般制备100ml纯酒精饱和溶液所需染料量:美兰2g~5g;结晶紫7g~14g;碱性复红3g~7g。??

三、常用的染色方法?
1、单染色法??即用一种染料染色的方法。常用吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液。?
染液?:①吕氏美兰液,美兰酒精饱和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成;②稀释石炭酸复红液??碱性复红酒精饱和液10ml+5%石炭酸溶液90ml,然后用蒸馏水作10倍稀释即成。?
2、菌种:大肠埃希菌普通斜面培养物。?
3、染色方法:于已做好的涂片上滴加吕氏美兰或稀释石炭酸复红染液,染色1min,以水冲洗至无颜色流下为止,自然干燥或以远火烘干后镜检。?????
4、结果:以美兰染色者菌体呈现兰色;以稀释石炭酸复红染色的菌体呈现红色。?